腹0水的纯化

采集复水后，12 000 r/min 离心 15 min，去掉 沉淀等杂质。往离心后的腹0水中加入等体积的 pbs，并添加---铵固体至 50% 饱和，静置 2 h，12 000 r/min离心15 min，弃 上 清，用 pbs 重 新 溶 解 沉 淀，然 后 再次加入---铵固体至 45% 饱和，静置两个小时左右，12 000 r/min 离心 15 min 弃去上清，用少量 pbs 溶解沉淀，即得到较纯的抗0体，对 pbs 透析除去---铵，透析时间为24 h，透析过程中更换透析液两至三次。

试剂与仪器

试 剂: pet28a-mrj 转 rosetta 菌 0种 由 本 实 验 室 所保存。免0疫佐剂 quickantibody 购自北京康碧泉公司;hat 选择性培养基、ht 培养基、8-azaguanine 和融合试剂 50% peg 购自美国 sigma 公司; 胎牛血0清及 prmi 1640 培 养 基 为 hyclone 产 品; 辣 根 过 氧 化 物 酶( hrp) 标记山羊抗小鼠 igg ; 8 周龄雌性健康 balb / c 小鼠，本实验室饲养; 小鼠骨0髓瘤细胞 sp2 /0 由---学赠送，融合前两星期复苏并经 8-azaguanine筛选; 其他试剂均为国产分析分析纯。

仪器: 二 氧 化 碳 培 养 箱( thermo) ; 倒 置 显 微 镜( olympus) ; 细胞培养耗材，96 孔板、24 孔板、6 孔细胞培养板、移液---( corning) ; 1 ml 的 a 蛋白层析柱

1.  第21天按同样方式加强免0疫1针。备注：每次佐剂和抗原现配现用。

2.  第35天采微量血进行elisa测定，抗0体滴度应在1:10000-1:10000000范围内，随后即可采全血或按常规方法进行抗原冲击免0疫和脾细胞融合。

3.  若抗0体滴度没有达到要求，可在第42天按同样方式加强免0疫1针。备注：通常情况下小鼠只需免0疫2针，而家兔往往需要免0疫3针。

4.  若免0疫3针，可在第52-56天采微量血进行elisa测定，抗0体滴度应在1:10000-1:1000000范围内，随后即可采全血或按常规方法进行抗原冲击免0疫和脾细胞融合。备注：佐剂免0疫效果有时也与抗原特性有关，若免0疫3针后仍达不到要求，不建议进行更多针次免0疫。